Эксперт

Сергей

Задать вопрос

Мы готовы помочь Вам.

Микроскоп для цитологических исследований должен иметь набор из 4-7 высокоапертурных объективов апохроматов, в том числе объективов 90х с нумерической (числовой) апертурой (A) 1,3—1,4; набор компенсационных окуляров; апланатический конденсор прямого и косого освещения с A не менее 1,4; штатив; механизмы фокусировки объективов и перемещения препаратов; бинокулярную насадку для наблюдения в микроскоп обоими глазами, набор светофильтров, а также точную центрировку всех оптических и механических деталей микроскопа. Кроме того, микроскоп должен быть оснащен осветителем, который может быть как вынесенным (ОИ-9м для МБР-3), так и встроенным (у микроскопов МБИ-6, МБИ-11, Микмед-1 вариант 2). Освещение устанавливают в соответствии с принципом Кёлера, который заключается в обеспечении условий для максимального использования апертур оптических компонентов микроскопа, т. е. в создании условий наблюдения, при которых числовые апертуры конденсора и объектива совпадают.

Конденсор состоит из 2 или 3 линз и обеспечивает освещение полей на объекте при работе с объективами с увеличением от 3,5 до 100х. Различают несколько типов конденсоров в зависимости от метода наблюдения в микроскопе: конденсор светлого поля, конденсор темного поля, конденсор для наблюдений по методу фазового контраста, конденсор с апертурной диафрагмой для косого освещения и др. Например, конденсор ОИ-14 кроме прямого освещения объекта обеспечивает косое, что позволяет получить более рельефное и контрастное изображение. 

Зеркало микроскопа имеет две поверхности – плоскую и выгнутую, оно располагается под конденсором и направляет в него свет. Из кондесора пучок света попадает на препарат, находящийся на столике микроскопа, а затем попадает в окуляр.

Визуальная насадка микроскопа (тубус), как правило, бинокулярная. Она позволяет устанавливать расстояние между осями окулярных тубусов в соответствии с глазной базой наблюдателя в диапазоне от 54 до 72 мм (на рисунке возможность изменения этого расстояния показана стрелками). В левом окулярном тубусе имеется диоптрийный механизм, который с помощью вращения кольца 2 позволяет компенсировать ошибку наблюдателя от плюс 5 до минус 5 дптр. Окулярные тубусы имеют наклон 45°. Увеличение бинокулярной насадки — 1,5^х.

В комплект микроскопа может входить монокулярная насадка, которая позволяет проводить исследование объектов только одним глазом. В отличие от бинокулярной насадки она имеет увеличение, равное 1^х. При использовании такой насадки можно применять полярофильтры для исследования в поляризованном свете. При работе с объективами, рассчитанными на длину тубуса, отличающуюся от стандартной 160 мм, применяется вертикальная насадка с прямым выдвижным тубусом. С помощью шкалы на выдвижном тубусе устанавливается механическая длина тубуса, на которую рассчитан объектив.

Окуляры нередко состоят из двух линз. Они могут иметь различное увеличение и позволяют проводить наблюдения в полях зрения разного диаметра (табл. 1). 

Таблица 1.

Характеристика некоторых окуляров

Окуляры строят мнимое изображение и увеличивают создаваемое объективами изображение, не выявляя подробностей строения. Маркировка окуляра позволяет определить его увеличение, а в некоторых случаях — диаметр поля зрения.

Револьверное устройство обеспечивает установку четырех объективов. Смена объективов производится вращением револьверного устройства за конусную поверхность до фиксированного положения. 

Объективы выполняют главную функцию: в их системе линз формируется первичное изображение, которое передается в окуляры. Объективы рассчитаны на механическую длину тубуса 160 мм, линейное поле в плоскости изображения 18 мм и толщину покровного стекла 0,17 мм. 

Большое значение имеет полное или частичное отсутствие в объективе оптических аберраций, которые могут привести к тому, что изображение объекта может быть искаженным вследствие его размытости, искривления, окрашенности. 

Аберрации оптики микроскопа могут быть разного типа. Сферическая аберрация — изображение точки передается в виде кружка рассеяния. Астигматизм — изображение точки передается в виде кружка рассеяния эллипсоидной формы. Кома — резкость изображения снижается от центра к границе поля зрения. Кривизна поля зрения не позволяет одновременно видеть резко центр и края поля зрения. Дисторсия — нарушения подобия между объектом и его изображением вследствие разного линейного увеличения на краях и в центре поля зрения. Хроматические аберрации — хроматизм увеличения и хроматизм положения. Хроматизм положения — изображения, созданные разными цвета­ми, располагаются на неодинаковом расстоянии от оптической системы. Хроматизм увеличения изображения находятся в одной плоскости, но имеют неодинаковые размеры. Высококачественные объективы-апохроматы изготавливают с высокой нумерической апертурой. В них устранены сферическая и хроматическая аберрации. Объективы-апохроматы применяются в сочетании с компенсационными окулярами.

Характеристики некоторых объективов указаны в табл. 2.

 Каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего расстояния в миллиметрах. При работе с объективами следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить линзы. Особенно это важно при работе с объективами с большим увеличением, для которых рабочее расстояние (расстояние между поверхностью покровного стекла и линзой объектива) составляет 0,10—0,12 мм.

Фокусирование на объект осуществляют перемещением тубусодержателя. Грубую фокусировку производят вращением рукояток макровинта, расположенных по обеим сторонам тубусодержателя. Диапазон грубой фокусировки микроскопа — 40 мм. Тонкую фокусировку производят с помощью микровинта, выполненного в виде диска с накаткой. Один оборот диска соответствует перемещению тубусодержателя на 0,5 мм, а вращение диска от упора до упора — не менее 2 мм. Перед началом работы необходимо установить рукоятку тонкой фокусировки приблизительно в среднее положение.

Таблица 2 

Некоторые характеристики объективов

Примечание. * Водная иммерсия. ** Масляная иммерсия

Препарат крепят на предметном столике с помощью клемм или держателей. Предметные столики могут быть различной формы, вращаемыми, оснащенными препаратоводителями с координатным перемещением объекта. В последних держатели можно перемещать относительно друг друга (в зависимости от размера предметного стекла) при помощи винтов 2.

Осветительные устройства могут быть вынесенными, накладными и встроенными. В случае вынесенного осветителя используется зеркало. Оно имеет две отражающие поверхности: плоскую и вогнутую. Вогнутую поверхность используют при естественном освещении, в отдельных случаях она может служить для повышения освещенности объекта. Накладные осветители ОИ-32М или ОИ-35 вставляют в посадочное гнездо в основании микроскопа. Встроенный в основание микроскопа осветитель включает галогенную лампу, коллекторную линзу, вблизи фокуса которой располагается нить лампы. 

2.2. Разрешающая способность

Каждый объектив характеризуется определенной разрешающей способностью, фокусным расстоянием (глубиной резкости) и увеличением.

Разрешающая способность объектива микроскопа (d) — наименьший диаметр частицы, которую можно увидеть при данном объективе, или то наименьшее расстояние между двумя линиями, при котором они видны как отдельные. Разрешающая способность объектива микроскопа зависит от значений нумерической (числовой) апертуры (A) объектива и конденсора и длины волны источника света (λ ). Для пучка лучей, параллельных оптической оси микроскопа, разрешающую объектива микроскопа определяют по формуле: 

d = λ/A (1.1)

Для наклонных лучей разрешающая способность в 2 раза выше:

d = λ/2A (1.2)

где: λ – длина волны, нм; А – числовая аппретура объектива.

Длина волны лучей источника света в видимой части спектра может меняться от 0,4 мкм (400 нм) для фиолетовых лучей до 0,7 мкм (700 нм) для красных. Следовательно, чем короче длина волны лучей источника света и чем больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объектива микроскопа, т. е. тем более тонкие структуры мы сможем увидеть в микроскоп. При освещении объекта наклонными лучами разрешающая способность объектива микроскопа в 2 раза выше, чем при освещении прямо падающими лучами. Освещая препарат синими лучами (λ = 0,47 мкм), т. е. применяя в осветителе синий светофильтр, можно изучать более тонкие структуры, чем при освещении обычным белым светом.

Пример: для объектива с A =1,4 при освещении белым светом (λ = 0,55 мкм) диаметр наименьшей видимой частицы при прямо падающем свете равен 0,39 мкм, при косом освещении — 0,20 мкм, а при освещении синим светом — 0,34 и 0,17 мкм,  соответственно. Максимальное разрешение, которое можно получить при использовании светового микроскопа, 0,20-0,35 мкм. Увеличить разрешающую способность можно при использовании ультрафиолетового света (длина волны 0,26—0,28 мкм), что позволяет получить разрешение 0,13—0,14 мкм.

2.3. Числовая апертура

Числовая, или нумерическая апертура (А) объектива характеризует светособирательную способность и определяется по формуле:

A= n×sinα (1.3)

где: n – показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом; α – половинный угол входного отверстия объектива (угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, другая образована линией, соединяющей точку выхода лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива) (рис. 2).

Рис. 2. Угол отверстия объектива микроскопа. Об- объектив; Кн – конденсор; Р – плоскость препарата; F- фронтальная плоскость; α – угол отверстия объектива. ( Пухальский и др., 2007)

2.4. Общее увеличение микроскопа

Увеличение объектива указано на оправе, там же указана и числовая апертура. Конденсоры тоже имеет определенную числовую апертуру. Если апертура конденсора меньше апертуры объектива, то возможности объектива, таким образом, используются в работе не полностью.

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива (V _об) на увеличение окуляра(V _ок):

V= V_об×V_ок (1.4)

Если объектив имеет увеличение 90х, а окуляр 15х, то общее увеличение равно 1350. Увеличения, превышающие эту величину, не имеют значения и их называют бесполезным. Это связано с тем, что структуру препарата окуляр может увеличить настолько, чтобы она просматривалась под тем же углом зрения что и в объективе. Это увеличение называется полезным, и оно равно 1000 А. Расчеты показывают, что полезное увеличение не может превышать 1300 -1450 раз. Большее увеличение не выявляет новых деталей на изображении, а освещенность его становится меньше.

2.5. Глубина резкости изображения

Глубина резкости изображения (глубина фокуса) — способность объектива одновременно давать резкие изображения точек, находящихся от него на разном расстоянии, или глубина препарата, видимая одновременно резко. Она зависит от увеличения микроскопа и апертуры объектива. Каждый объектив позволяет видеть препарат на определенную глубину в одной плоскости. На большом увеличении необходимо поочередно фокусировать объектив в разных плоскостях. На малых увеличениях и малой апертуре глубина резкости больше, чем при больших увеличениях. Показатель глубины резкости следует особенно учитывать при микрофотографии, когда необходимо четко видеть изображение объекта в одной плоскости зрения. Глубина резкости – это глубина препарата, видимая одновременно резко. Её определяют по формуле: 

T = (1000/7A×V)+(λ/2A²) (1.5)

При небольших увеличениях и малой апертуре глубина резкости больше, чем при больших увеличениях и высокой апертуре.

Качество микроскопа определяется не увеличением, а разрешающей способностью оптических устройств. 

В случае сухих объективов (без использования жидких сред — иммерсии) коэффициент преломления равен единице (п = 1) и NA < 0,95.

Иммерсионная система — объектив микроскопа, у которого пространство между фронтальной линзой и рассматриваемым предметом заполнено жидкостью с более высоким показателем преломления, чем воздух. Для иммерсионных объективов нумерическая апертура зависит от показателя преломления жидкости, находящейся между препаратом и объективом. Поэтому для водноиммерсионных объективов NA меньше либо 1,25 (вода имеет n = 1,33), а для масляно — иммерсионных объективов NA меньше либо равно 1,4 (кедровое масло имеет n = 1,515). На рисунке 3 представлен ход лучей при использовании масляной иммерсии и сухого объектива. Как видно из этого рисунка, в сухой системе некоторая часть лучей не попадает в объектив, так как при выходе из покровного стекла, они отклоняются. Лучи, которые в месте выхода к поверхности стекла образуют угол больше 41^о (предельный угол), полностью отражаются. Для стекла и воды предельный угол равен 41°, для кедрового масла и стекла, он не существует по причине равенства показателей их преломления. Для улучшения качества изображения часто применяется полная иммерсия, когда иммерсионную жидкость наносят и на конденсор.

Рис. 3. Сравнение хода лучей при использовании сухого (слева) и иммерсионного масляного (справа) объективов. 

При работе с иммерсионными объективами следует соблюдать осторожность, чтобы при опускании тубуса не повредить линзу.

Иммерсионную жидкость наносят между линзой и объективом в виде капли на поверхность покровного стекла препарата и, опуская затем тубус, погружают линзу в каплю иммерсии. Иммерсионную жидкость можно нанести и на поверхность линзы объектива либо по капле и на препарат, и на объектив. Главное требование — создание иммерсии без пузырьков воздуха.

Только в случае соответствия апертур коллектора осветителя, конденсора и объектива разрешающая способность оптики микроскопа используется полностью. 

Задание 1. Определение зависимости Т и d от длины волны

Ознакомиться с объективами, окулярами и конденсором биологического микроскопа. Приготовить временный препарат кожицы лука и рассмотреть его при разных длинах волн, используя цветные светофильтры, красный и синий. Зарисовать препарат при трех длинах волн. Определить, при какой длине волны видны более мелкие детали. Рассчитать разрешающую способность и глубину резкости. Результаты занести в табл.3. 

Таблица 3.

Зависимость разрешающей способности и глубины резкости от длины волны света.

Сделать вывод о зависимости d и T от длины волны (λ).