Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. 1. Изучение физико-химических свойств вспененного полиэтилена
      1. Плотность и способность к влагонасыщению
      2. Оптические свойства
      3. Термоустойчивость
   2. Применение вспененного полиэтилена для иммобилизации клеток водорослей
      1. Таксономический состав водорослей, иммобилизованных на вспененном полиэтилене
   3. Функциональные показатели иммобилизованных клеток
      1. Концентрация зелёных пигментов
      2. Биомасса иммобилизованных водорослей
      3. Структурно-функциональные характеристики

1. Устойчивость иммобилизованных клеток водорослей к модельному токсиканту (сульфату меди)

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Микроводоросли находят применение в научных исследованиях, производстве органических веществ и экологии. Многие полезные свойства водорослей связаны с их таксономической принадлежностью, а также с условиями роста и развития. Интерес к методам увеличения скорости роста микроводорослей возрос в связи с недавно открытой возможностью получения из них биотоплива и других видов биопродукции (Tate et al., 2013). Водоросли играют важную роль в биогеохимических оборотах биогенных элементов в экосистемах (Pérez-Martínez, et al., 2010), а также в балансе тяжелых металлов (Pradhan, Rai, 2001).

В природе встречаются свободноживущие и прикрепленные к субстрату микроводоросли. Оба способа существования находят применение и в лабораторных способах их выращивания. В последние годы внимание исследователей привлекают иммобилизованыые культуры водорослей (Mallik, 2006; Pérez-Martínez, et al., 2010), так как иммобилизация способна повысить интенсивность биохимических процессов.

В качестве материала для иммобилизации часто используют альгинат кальция (альгинат натрия), благодаря их высокой способности удерживать воду и клетки водорослей. Вместе с тем, разрабатываются и другие материалы для иммобилизации (силикаты, агар-агар, хитозан) (Mallik, 2006).

Появление на рынке вспененного полиэтилена и предварительный анализ его свойств (нейтральность по отношению к среде, отсутствие окраски, способность пропускать свет, большая адсорбирующая поверхность, пористость) позволил высказать предположение о возможности его использования для иммобилизации клеток водорослей. 

Целью настоящей работы явилась оценка возможности использования вспененного полиэтилена для иммобилизации клеток водорослей.

Задачи работы следующие:

1. Изучить физико-химические свойства вспененного полиэтилена.
2. Исследовать возможность иммобилизации  водорослей на поверхности вспененного полиэтилена.
3. Исследовать устойчивость иммобилизованных клеток водорослей к модельному токсиканту (сульфату меди).

Работа выполнена на кафедре водных и наземных экосистем Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.   

I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1. I.1.Потенциальные возможности практического использования иммобилизованных клеток водорослей

Коммерческое использование водорослей имеет длительную историю. Многие виды водорослей используются в качестве пищи и как источники различных химических соединений. Некоторые метаболиты, синтезируемые водорослями, имеют большую коммерческую ценность. При этом встает проблема получения достаточной биомассы водорослевых культур. Процесс культивирования водорослей весьма сложен, требует больших вложений и часто не приносит больших прибылей. В качестве решения этой проблемы предложены методы иммобилизации водорослевых клеток. 

В ранних работах Spoehr and Milner (1949, цит. по Mallik, 2006) предполагалось, что массовые культуры микроводорослей позволят решить проблему пищевого белка в глобальном масштабе. В последние годы были разработаны различные инновационные подходы к иммобилизации и микроинкапсуляции, которые доказали преимущество иммобилизированных клеток перед свободными. Кроме того, иммобилизация клеток может использоваться для мониторинга загрязнения естественной водной среды (Mallik, 2006;). 

В одном из обзоров (Hameed, Ebrahim, 2007) дана оценка различным подходам к получению и использованию иммобилизованных культур водорослей, детально рассмотрены методы иммобилизации и их воздействие на функционирование клеток. Особое внимание уделено использованию иммобилизации в очистке и удалении тяжелых металлов из сточных вод. Другие важные сферы применения иммобилизованных водорослей, такие как биореакторы и токсикологические тесты, также рассмотрены в данном обзоре. 

Эксперименты, в которых изоляты цианобактерий были отобраны из загрязненной водной среды и определены по морфологическим и культурологическим характеристикам, приведены в работе (Sri Kumaran N. et.al., 2011). Каждый изолят был определен методом дилюции при различных концентрациях (от 10 до 1000 мкг/л^-1) никеля, кадмия, железа, свинца и цинка. Каждые три дня отбирались пробы культур для оценки роста, рН и количества изъятых из среды тяжелых металлов. Из следующих видов: Anabaena sp., Trichodesmium sp.,Oscillatoria sp., Cylindrospermopsis sp. и Nostoc sp.последний показал наибольшую устойчивость к загрязнению тяжелыми металлами и наибольшую способность к их удалению: в течение эксперимента им были удалены 95,4% кадмия, 97,7% железа, 99,6% свинца, 88,23% никеля и 75,% цинка. 

Важным направлением исследований является сравнение чувствительности свободных и иммобидизованных клеток. На примере  Chlorella vulgaris показаны реакции организма на присутствие в воде токсичных микроэлементов, таких как цинк, никель и кадмий. Общее снижение интенсивности роста, фотосинтетической активности, активности нитратредуктазы и алкалинфосфатазы рассматривалось как функция концентраций металлов. В иммобилизованных клетках наблюдалось значительное увеличение активности нитрат-редуктазы по сравнению со свободными клетками. Два различных состояние клеток показали весьма существенное различие фиксации диоксида углерода и выделения кислорода: иммобилизованные клетки фиксируют вдвое больше углерода, чем свободные, что стимулируется низкими концентрациями никеля и цинка (Mamta Awasthi et al., 2005).

Устойчивость Chlorella vulgaris к меди изучали методом сравнения физиологических характеристик и поглощения меди штаммов «дикого типа» и устойчивых к меди. Уменьшение скорости роста, сухой массы, содержания хлорофилла а, протеинов, аминокислот и сахаров наблюдалось в обоих штаммах при концентрациях меди 1,0 и 400 мкг/л^-1. Снижение всех параметров было сильнее выражено в штаммах «дикого типа», чем в «устойчивых». Устойчивые штаммы имели сравнительно незначительные потери калия и натрия. В обоих видах штаммов была выявлена положительная связь аккумуляции пролинов с уровнем токсичности меди. Поглощение меди сильно зависело от ее концентрации в среде: чем меньше концентрация этого элемента, тем больше активность его поглощения и аккумулирующая способность клеток (Fathi et al., 2005). 

Другим немаловажным направлением использования иммобилизованных клеток водорослей является создание оптических биосенсоров на основе клеток Chlorella vulgaris для определения токсичных веществ (Naessens et al., 2000) 

Иммобилизацию клеток микроводорослей многие исследователи проводят на альгинате. Альгинаты – это соли альгиновой кислоты, которая является полисахаридом, извлекаемым из бурых водорослей. Это вязкое резиноподобное вещество. Её соли — альгинат натрия, альгинат калия и альгинат кальция  используются в пищевой промышленности.

Удаление азота и фосфора из среды изучалось при помощи нового метода иммобилизации клеток, системы двух слоев: клетки микроводорослей фиксируются на первом слое, влажном, микропористом и ультратонком, а второй слой, противолежащий первому, имеет макропористую структуру и является питательным субстратом для клеток. Были взяты два вида зеленых микроводорослей: Chlorella vulgaris и Scenedesmus rubescens; обе водоросли эффективно удаляли нитраты из городских сточных вод. В экспериментах с использованием искусственных растворов водоросли уменьшали концентрацию фосфатов, солей аммония и нитратов до менее чем 10% от первоначальной в течение девяти дней. (Shi, Podola, Melkonian, 2007)

Иммобилизованные клетки зачастую обладают рядом преимуществ перед свободными клетками. Фиксация клеток Chlamydomonas reinhardtii на альгинате увеличивает их фотодыхательную активность. В фиксированных (иммобилизованных) клетках секреция фотодыхательного фермента фосфоглюколатфосфотазы на 75% выше, чем в свободно взвешенных клетках. Скорость продукции гликолата в фиксированных клетках вдвое выше, чем в свободных, при добавлении в среду аминооксиацетата (ингбитора трансаминазы) (Garbayo I. et al., 2005). Но данная тенденция не всегда себя проявляет. Исследование эффективности применения водорослей, иммобилизованных с помощью альгината в in situ фитотоксических тестах для оценки качества воды небольших загрязненных пригородных водоемов показало, что такие показатели токсичности воды, как рост и чувствительность клеток, приблизительно одинаковы для иммобилизованных и свободных водорослей. (Tamanaha M.S. et al., 2009)

Ряд работ проводилось для установления наилучших параметров для высокой скорости роста, высокой биохимической активности и других признаков иммобилизованных микроводорослей. Например, проводились исследования по влиянию света, величины рН и источников органического углерода на продукцию водорода водорослью Chlorella. Источником света, обеспечивающим наибольшее время продукции водорода, является оптическое волокно; оптимальный уровень продукции водорода достигался при рН=8,0. В качестве источников органического углерода были взяты глюкоза, фруктоза, сахароза и солодовый экстракт. Наибольший объем произведенного водорода (1,315 мл/л) наблюдался при добавлении сахарозы, а наибольшая скорость его продукции (24 мл/л/ч) – в присутствии фруктозы. (Rashid N. et al., 2012)

Основные требования к эффективной системе иммобилизации водорослей и свойствам идеальной матрицы для иммобилизации представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Требования к эффективной системе иммобилизации водорослей и свойствам идеальной матрицы для иммобилизации.

Требования к системе иммобилизации водорослей	Свойства идеальной матрицы для иммобилизации водорослей
Сохранение жизнеспособности Возможность фотосинтеза Высокая плотность клеток Непрерывная производительность Слабое отлипание клеток от матрицы	Нетоксичность Светопрозрачность Стабильность среды роста Сохранение биомассы Устойчивость клеток к нарушениям (сбоям)

1. 1. Свойства и основные характеристики вспененного полиэтилена

Вспененный полиэтилен (ВПЭ), пенополиэтилен ППЭ – «expended polythene»  (EPE) относится к так называемому классу газонаполненных (пенополимеров или поропластов) термопластичных полимеров (термопластов). Пенолимерами принято называть органические высокопористые материалы, получаемые из синтетических смол. Их часто называют пенопластами или поропластами, а также газонаполненными ячеистыми пластмассами. Пенополимеры представляют собой гетерогенные дисперсные системы, состоящие из твердых и газообразных фаз.

Газонаполненные пластмассы — это двухфазные системы, состоящие из полимерной матрицы и относительно равномерно диспергированной газовой фазой. Такая структура пластмасс обуславливает некоторую общность их свойств, а именно — чрезвычайно малую массу, высокие тепло- и звукоизоляционные характеристики.

Вспененные изделия могут принимать любую физическую форму – плиты, пленки, листа, обруча, нити, прутка, профиля, слоеных плит и т.п. Удельный вес (плотность) вспененных изделий обычно находится в диапазоне от 5 до 800 кг/м³ с размером вспененной ячейки от 0,05 мм до 15 мм. Содержание количества ячеек в структуре материалов можно изменять от 0 до 100 %, в зависимости от выбранных сырья и технологического процесса (ррр).

Учитывая данные характеристики, ВПЭ может применяться во множестве различных областей, таких как: 

• строительство
• безопасная транспортировка товаров 
• использование в качестве утеплителя оконных и дверных конструкций
• теплоизоляция для труб холодного и горячего водоснабжения
• шумопоглощение
• пароизоляция для сооружений и помещений

А также великолепные результаты дает его использование, как укрывной пленки в зимний период. Еще одной из областей применения является широкий перечень спортивного снаряжения. Туристические коврики, незаменимые на любом привале, специальные подкладки смягчающие нагрузку от рюкзаков; в современных туристических байдарках и спасательном жилете, обязательном для сплава по горной речке, также применен пенистый полиэтилен.

Свойства вспененного полиэтилена:

• Отличная гибкость, эластичность
• Хорошая водо- и паронепроницаемость
• Низкая теплопроводность
• Отличные звуко- и шумопоглощающие свойства
• Химическая и микробиологическая стойкость 
• Экологическая чистота: не выделяют токсинов, не вызывают аллергических реакций.
• Рабочий температурный диапазон от -60 до +800С

Стойкость материала такова, что ему не страшна даже морская вода. Вариантов применения полиэтилена, вспененного бутанами и пропанами, очень много и можно констатировать, что количество их расширяется с каждым днем. В нашем исследовании он был выбран как материал для иммобилизации водорослей, т.к. его физико-химические свойства отвечали требованиям для субстрата, используемого в биотехнологических целях (Электронный ресурс: Вспененный полиэтилен, 2013).

1. 1. Общие представления о фотосинтетических пигментах водорослей

Хлорофилл «а» — сложный эфир хлорофиллина (дикарбоновой кислоты), одна карбоксильная группа которой этерифицирована остатком метилового спирта, другая – остатком фитола (высокомолекулярного спирта). Эмпирическая формула хлорофилла «а» — С₅₅Н₇₂О₅N₄Mg, молекулярная масса 893. Хлорофилл «b» отличается от хлорофилла «а» тем, что метильная группа (-СН₃) при С₃ атоме углерода в пирольном кольце II заменена на альдегидную группу (-СНО). Эмпирическая формула хлорофилла «b» — С₅₅Н₇₀О₆N₄Mg, молекулярная масса 907. Хлорофилл «с» в отличие от хлорофиллов «а» и «b» не имеет остатка фитола, пирольное кольцо IV не восстановлено. Эмпирическая формула хлорофилла «с» — С₃₄Н₃₀О₄N₄Mg, молекулярная масса 579. 

В растворенном состоянии все хлорофиллы показывают флуоресценцию в красной области спектра. In vivo флуоресцируют только молекулы хлорофилла «а» в составе хлорофилл-белкового комплекса фотосистемы 2 и светособирающего хлорофилл a/b белкового комплекса.

Отношения хлорофиллов «a»/«b» у различных растений были определены у многих растений еще в начале 20 века были определены Любименко, Вильштеттером и Штолем, Зейбольдом и Эгле (по Рабинович, 1951). 

Содержание хлорофилла является важным показателем физиологического состояния растений. Во многих случаях хлорофилл определяет фотосинтетический потенциал и первичную продукцию отдельного растительного  организма фитоценоза. Косвенно хлорофилл связан с условиями минерального питания, реагируя на дефицит азота, магния и железа. Известно также отрицательное влияние на содержание хлорофилла вредных факторов окружающей среды (Brzezinska, 2006). 

Содержание хлорофилла по отношению к площади анализируемой поверхности применяют в исследованиях фитоперифитона. Перифитон малых рек Кольского полуострова, сформированный видами с нитчатой структурой таллома (Ulothrix  zonata, Bulbochaete sp., Oedogonium sp., Spirogyra sp., Zygnema sp., Mougeotia sp.), характеризовался следующими значениями содержания хлорофилла: минимальное – 0,1 мкг/см², максимальное 92 мкг/см², средние значения изменялись от 2,8 до 8.8 мкг/см² (Кумулайнен и др., 2009). Перифитон р. Енисей ниже г. Красноярск, в составе которого доминировали диатомовые и зеленые водоросли, содержал до 50 мкг хлорофилла «а» на 1 см² На искусственном субстрате показатель достигал величин 150 – 200 мг/м² (Saravia, 1999). 

Учитывая различные способы выражения содержания хлорофилла на единицу площади, имеет смысл привести основные соответствия: 1 мкг/см² = 0,1 мг/дм²; 1 мкг/см²=10 мг/м²; 1 мг/дм² = 100 мг/м². 

Способом выражения содержания хлорофилла в тканях растений также является отношение массы пигмента к сырой или сухой массе растительного материала. В первом случае для листьев можно встретить следующие величины: 2,52 мг хлорофилла на 1 г сырой массы (Glycine max), 1,39 (Ipomoea batatas), 1,23 (Brassica oleracea), 2,88 (Hordeum vulgare), 2,57 (Phragmites communis), 5,7 (Miscanthus sacchariflorus) (Masami Monsi, 2005). Во время превращения хлоропластов в хромопласты у Lilium petals концентрация хлорофилла снижалась от 0,1 до 0,02 мг/г сырой массы (Juneau, 2002). Во втором – содержание хлорофилла на грамм сухой массы составляло: 6,2 и 7,4 мг/г в листьях морошки (Rubus Chamaemorus) (Назаров, 1978). 8,9 мг/г сухой массы в листьях рогоза узколистного (Typha angusolia) (Ратушняк и др., 2008).

От содержания хлорофилла в мг на грамм сырой массы легко перейти к процентному содержанию: 1 мг хлорофилла/г сырой массы соответствует 0,1%.  Содержание хлорофилла «а» в природных водах связно с развитием прокариотических и эукариотических водорослей. Обычными единицами оценки концентрации хлорофилла в этом случае служат мкг/л и мг/м³. Варьирование показателя в широких пределах от 0,1 мкг/л до 200 мкг/л и более позволяет судить о состоянии водных экосистем, трофическом статусе водоема и качестве воды (Китаев, 1984; Оксиюк, 1993).

В гидробиологии содержание хлорофилла «а» (Схл) часто используют как показатель биомассы (В) водорослей. Для этого необходимо знать величину отношения β=Схл/В. Многочисленные исследования демонстрируют изменчивость этого показателя. В работе (Апонасенко, 2007) указан интервал изменения величины β от 0,1 до 9,7%. Средние значения β для реки Енисей составляли 1,33%, для Красноярского водохранилища – 0,54%. Отношение хлорофилл/биомасса в перифитоне составляло от 0,18 до 0,49% (Кумулайнен и др., 2009). По оценке В.В. Бульона  (Бульон, 1983), сделанной на основе большого количества измерений, среднее значение β равно 0,2%, или хлорофилл «а» составляет 1/500 часть от сырой биомассы клеток водорослей. Эту величину используют в расчетах, когда собственная оценка величины β не проводилась. 

По химическому составу каротиноиды относятся к полиизопреноидам, состоящих, как правило, из 40 атомов углерода (5 атомов углерода входит в состав изопрена, 8 молекул изопрена образуют основу углеродного скелета молекулы). У многих желтых пигментов полиизопреноидная структура заканчивается иононовыми кольцами различных типов. Центральная часть молекулы состоит из 18 атомов углерода, образующих коньюгированную систему двойных связей, которая и определяет основные спектральные свойства каротиноидов. Каротиноиды – жирорастворимые пигменты. Для их извлечения из клетки используют как полярные (этиловый эфир, этиловый спирт, ацетон), так и неполярные (бензин, петролейный эфир) растворители. 

Каротиноиды, не содержащие в своем составе атомов кислорода, представлены каротинами, среди которых в зеленых листьях большая доля приходится на β-каротин. Каротиноиды, в молекулы которых включен кислород, получили название ксантофиллы. Среди них наиболее распространены лютеин, виолоксантин, зеаксантин и неоксантин.

В присутствии молекулярного кислорода происходят химические превращения каротиноидов, вызванные появлением гидроксильных и эпоксидных групп. Так ксантофилл антероксантин при 50°C в присутствии О₂ за 24 часа частично окислялся в диэпоксид виолоксантин. Превращения происходят и в кислой среде, например, 5,6-эпоксиды (неоксантин и  виолоксантин) становятся 5,8-эпоксидами. Эти изменения в структуре молекул желтых пигментов влияют на их спектральные свойства.

Фикобилины представляют группу вспомогательных пигментов, распространенных у синезеленых, криптофитовых и красных водорослей. Тетрапирольная структура хромофора в отличие от хлорофиллов не образует кольца и не содержит атома металла. У синезеленых водорослей фикобилины соединяются с белком, образуя надмолекулярные структуры фикобилисомы. Три основных представителя фикобилинов – фикоэритрин, фикоцианин (окисленный фикоэритрин) и аллофикоцианин поглощают свет в зеленой и желтой (540 – 570 нм), оранжевой и красной (615 – 650 нм) областях спектра, показывают собственную флуоресценцию и осуществляют процесс передачи хлорофиллу «а» и. Фикобилины выделяют из разрушенных клеток водную среду в составе пигмент белковых комплексов. Структурная формула фикоэритробилина и спектры поглощения фикобилинов в фосфатном буфере (рН 7,5) показаны на рисунке 3.

Растворы аллофикоцианина и фикоцианина окрашены в голубой цвет. Максимум поглощения аллофикоцианина 650 нм, максимум флуоресценции 660 нм. Соответствующие показатели у фикоцианина – 620 нм и 640 нм. Раствор фикоэритрина имеет красную окраску. Существует несколько спектральных форм фикоэритрина. Одна из распространенных «красных» форм – R-фикоэритрин имеет максимумы поглощения при 498, 545 и 565 нм, максимум флуоресценции при 575 нм. Фикобилипротеиды в водном экстракте обладают флуоресценцией в оранжевой и красной областях спектра. In vivo регистрируют флуоресценцию аллофикоцианина в красной части спектра.

Содержание фикобилинов в сухой биомассе красной водоросли Ceramium rubrum изменялось от 0,9% летом до 1,9% зимой. Доля фикоэритрина при этом составляла 0,33 и 0,25 соответственно. Отношение фикоэритрина к хлорофиллу у красных водорослей, по данным Любименко (цит. по Рабинович, 1951), увеличивалось от 0,06 до 0,66 с ростом глубины обитания. У синезеленой водоросли Anacystis nidulans фикоэритрин присутствовал в следовых количествах, а отношение фикоцианин/хлорофилл составляло 0,57, аллофикоцианин/хлорофилл – 0,097 (Kursar, 1983).

Методы, применяемые для определения содержания пигментов в растениях, делят на те, которые требуют экстракции, и те, которые не требуют экстракции пигментов. К первым относятся фотоколориметрия, спектрофотометрия, флуориметрия и хроматография, ко вторым – флуориметрия, спектроскопия проходящего и отраженного света, обработка изображения, полученного с помощью цифровой фотокамеры.

1. 1. Флуоресцентная оценка таксономической структуры фитопланктона

Качественный состав пигментов в клетках фотосинтетиков закреплен генетически и связан с их филогенией (Wilhelm C., Kramer P., Wiedemann I., 1987). Из анализа этих различий можно заключить, что наиболее значимых параметры в спектре действия флуоресценции хлорофилла а связаны шестью группами фитопланктона, содержащими в составе клеток хлорофиллы а и в (Prochlorophyta, Chlorophyta, Euglenophyta), содержащими хлорофиллы а и с (Raphydophyta, Xanthophyta), содержащими хлорофиллы а, с и каротиноид фукоксантин (Bacillariophyta, Dinophyta, Chrysophyta), содержащими хлорофиллы а, с и фикобилины (Cryptophyta), содержащими хлорофиллы а, d и фикобилины (Rhodophyta), содержащими только хлорофилл а и фикобилины (Cyanophyta, Rhodophyta). Гетерогенность состава желтых пигментов в силу близости спектров поглощения вряд ли будет полезной при идентификации спектров действия флуоресценции хлорофилла а.

Из представленных пигментов только хлорофилла а и фикобилины способны флуоресцировать in vivo. Хлорофиллы в и с флуоресцируют в органических растворителях, но не флуоресцируют в составе пигмент белковых комплексов. Причина этого – практически 100% эффективность передачи поглощенной энергии от молекул хлорофилла в и с молекулам хлорофилла а. Желтые пигменты не способны к флуоресценции в силу своего химического строения. Фикобилины флуоресцируют в растворе и в составе пигмент белковых комплексов живых клеток. Эффективность передачи поглощенной ими световой энергии на хлорофилл а высока, но все же не достигает 100%, как в случае с хлорофиллами в и с. Спектры флуоресценции хлорофилла а и фикоцианина в составе цианобактерии Oscillatoria показаны на рис.2. Максимум флуоресценции хлорофилла а (686 нм) в равной степени выражен при возбуждении светом 420 и 578 нм. Флуоресценция фикоцианина отсутствует при возбуждении светом 420 нм и имеет максимум при 665 нм, когда длина волны возбуждающего света составляет 578 нм. Спектры флуоресценции фикоцианина и хлорофилла а значительно перекрываются. Поэтому при возбуждении синим светом флуоресценция цианобактерий и криптофитовых водорослей в диапазоне длин волн >680 нм обусловлена одним хлорофиллом а, тогда как при возбуждении зеленым и желтым светом – хлорофиллом а и фикоцианином.

До настоящего времени не известны попытки использовать генетически закрепленные различия фотосинтетических пигментов для флуоресцентного разделения сообщества фитопланктона на шесть перечисленных выше групп. 

Yentsch C.S. и Phinney D.A. одними из первых предложили использовать различия в спектре действия флуоресценции для изучения таксономической неоднородности полей фитопланктона (Yentsch, Phinney, 1985). В качестве основного показателя было взято отношение сигналов флуоресценции, обозначенное САР от «chlorophyll accessory pigment»), у микроводорослей в области 685 нм при возбуждении двумя спектральными полосами — 530 и 450 нм 

По величине САР, изменявшегося от 0.1 до 0.9, можно было отличить зеленые одноклеточные водоросли от диатомовых и динофлагелят. Однако промежуточные значения 0.3-0.4 могли возникнуть при наличии в пробах как золотистых водорослей так и смеси зеленых и диатомовых. Также в работе не предлагалось использовать величину САР для количественной оценки соотношения двух таксономических групп водорослей.

Практически одновременно появилась работа (Гольд, Гаевский, Шатров, Попельницкий, Рыбцов, 1986) в которой была показана возможность флуоресцентного определения содержания хлорофилла а в клетках водорослей, принадлежащих трем экологически значимым для внутренних водоемов отделам (Cyanophyta, Bacillariophyta, Chlorophyta). Метод удовлетворительно работал как в смесях лабораторных культур водорослей, так и в природных сообществах фитопланктона. 

II.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования был новый теплоизоляционный материал – вспененный полиэтилен (ВПЭ). 

Кубики из неокрашенного ВПЭ размером 1◊1◊1 см готовили с помощью острого ножа.

Удельная плотность кубиков в воздушно сухом и насыщенном водой состоянии определяли весовым методом.

Термоустойчивость кубиков из ВПЭ исследовали не основе визуальных изменений формы по мере нагрева насыщенных водой образцов на водяной бане от комнатной температуры до температуры кипения воды.

Светопропускание образца ВПЭ толщиной 1 см определяли с помощью люксметра.

Иммобилизацию клеток водорослей осуществляли в микроэкосистемах:

МЭС-1. Аудитория 43-14. Объем 300 литров. Непрерывное искусственное освещение белыми люминесцентными лампами (1500 Лк), расположенными над поверхностью аквариума. Постоянная аэрация и фильтрация воды. Дно песчаное. Высшая водная растительность (виды растений). Животный мир: прудовик малый, катушка, неоны, гурами;

МЭС-2. Аудитория 43-19. Объем 300 литров. Фотопериод, боковое естественное освещение (550 Лк). Постоянная аэрация. Дно галечное. Высшая водная растительность отсутствует. Животный мир: рак речной, гуппи. 

Кубики в количестве 15-17 шт. были нанизаны на леску с промежутками 1 – 1,5 см. На верхнем конце лески находился поплавок, на нижнем – груз. В таком виде кубики из ВПЭ помещались в МЭСы (рис. 1), где находились в течение 33 дней. Количество повторностей – 3.

 

Рисунок 1 – Внешний вид кубиков из ВПЭ, размещенных с помощью лески в МЭСы.

Таксономический состав водорослей исследовали после их механического отделения от кубика ВПЭ в отстоянную водопроводную воду.

Таксономический состав определяли с помощью с помощью профессора кафедры водных и наземных экосистем доктора биологических наук Е.А. Ивановой с использованием светового микроскопа Primo Star Carl Zeiss и камеры Горяева. 

Концентрацию хлорофиллов определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве растворителей этиловый спирт (96%) и ацетон (90%). Расчетные уравнения взяты из работ (Jeffrey, Humphrey, 1975; Wintermas, Mats, 1965 [цит. по Шлык, 1971]).

Флуоресцентные характеристики клеток иммобилизованных водорослей исследовали с помощью приборов PHYTO-PAM и IMAGING-PAM Maxi-Ver (Walz, Германия).

PHYTO-PAM позволял определить фотосинтетическую активность иммобилизованных водорослей по трем основным отделам (зеленые, синезеленые и диатомовые) водорослей. Показателем фотосинтетической активностью были максимальный выход флуоресценции и максимальная скорость электронного транспорта (Genty et al., 1989).

Раствор сульфата меди в различных концентрациях был приготовлен их химического препарата марки Х.Ч.

Действие токсиканта на иммобилизованные клетки изучали в условиях вращающегося культиватора (60 об/мин) при температуре 25∞С и непрерывном освещении люминесцентными лампами (1500 Лк) (рис. 2). Кубики с иммобилизованными водорослями помещали в пенициллиновые сосудики, в которые добавляли по 10 мл раствора сульфата меди на отстоянной водопроводной воде. Каждая концентрация ионов меди была представлена тремя повторностями.

 

Рисунок 2 — Вращающийся культиватор.III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. 1. Изучение физико-химических свойств вспененного полиэтилена

1. 1. 1. Плотность и способность к влагонасыщению

Были изучены плотностные и водоудерживающие характеристики вспененного полиэтилена (ВПЭ). Размер образца 1 см³. Способность материала к насыщению водой и содержание влаги показаны в таблице 2.

Таблица 2 – Плотностные и водоудерживающие характеристики вспененного полиэтилена.

Удельная плотность ВПЭ, г/см3	Удельная плотность ВПЭ, насыщенного водой, г\см3	Содержание влаги в насыщенном водой ВПЭ, %
0,026+0,001	0,165+0,012	83,8+1,1

Как в сухом, так и в насыщенном водой состоянии вспененный полиэтилен обладает положительной плавучестью (удельная плотность < 1г/см³). Для исследованных образцов ВПЭ свойственна высокая водоудерживающая способность. По содержанию влаги ВПЭ близок к живой растительной ткани (Медведев, 2013). 

1. 1. 1. Оптические свойства

Оптические свойства ВПЭ оценивали по величине коэффициента ослабления естественного белого света (k). Неокрашенный вспененный полиэтилен толщиной 1 см показал k=0,25+0,01см^-1, что соответствует величине светопропускания T=56%. 

1. 1. 1. Термоустойчивость

Устойчивость к высокой температуре оценивали по деформации материала (визуально) при нагревании кубиков (1 см³) на водяной бане в течение 15 минут. Видимая деформация проявилась при температуре 90^оС, что согласуется с заявленными производителем свойствами ВПЭ (компания «Ава-лот»), гарантирующими термоустойчивость до 80^оС. Это свойство ВПЭ позволяет осуществлять при необходимости пастеризацию изделий из ВПЭ перед их использованием в биотехнологических целях. 

Таким образом, проведённые исследования показали потенциальную пригодрость для использования вспененного полиэтилена в качестве материала для выращивания растений и иммобилизации водорослей в соответствии с требованиями (статья про иммобилизацию).

1. 1. Применение вспененного полиэтилена для иммобилизации клеток водорослей

1. 1. 1. Таксономический состав водорослей, иммобилизованных на вспененном полиэтилене

На 23 сутки нахождения образцов ВПЭ в МЭС-1 и в МЭС-2 можно было увидеть обрастание кубиков водорослями, о чем свидетельствует изменение их цвета (рис. 3).

 

Рисунок – 3. Внешний вид кубиков из ВПЭ после 23 суток нахождения в МЭС-1 (А) и в МЭС-2 (Б).  

Как видно из рисунка обрастание кубиков было выражено в одинаковой степени.

Таксономический состав водорослей, иммобилизованных на ВПЭ,  представлен в таблице 3.

Таксономическая характеристика	МЭС — 1		МЭС-2
	23 суток	33 суток	23 суток	33 суток
Синезеленые: Oscillatoria limnetica	В массе	В массе	В массе	В массе
Oscillatoria amoena	В массе	В массе	Не обнаружен	Не обнаружен
Synechococcus sp.	Не обнаружен	Единичные клетки	Не обнаружен	Не обнаружен
Microcystis pulverea	Не обнаружен	В массе	Не обнаружен	Не обнаружен
Lyngbya sp.	Не обнаружен	Не обнаружен	Не обнаружен	Умеренное  количество
Зелёные: Cladophora sp.	Не обнаружен	Не обнаружен	Умеренное  количество	Не обнаружен
Mougeotia sp.	Умеренное  количество	Умеренное  количество	Не обнаружен	Не обнаружен
Диатомовые: Achnanthes sp.	В массе	В массе	Не обнаружен	Не обнаружен
Eunotia veneris	Не обнаружен	Не обнаружен	Единичные клетки	Умеренное количество
Fragilaria var.binodis	Не обнаружен	Не обнаружен	Умеренное количество	Умеренное количество
Fragilaria capucina	Единичные клетки	Не обнаружен	Единичные клетки	Умеренное количество
Эвгленовые: Euglena sp.	Не обнаружен	Единичные клетки	Не обнаружен	Не обнаружен

Проведённый эксперимент показал возможность иммобилизации на погруженном в воду вспененном полиэтилене нитчатых форм синезелёных, нитчатых форм зелёных водорослей, клеток диатомовых и эвгленовых водорослей. Таксономический состав водорослей в МЭСах был различным. Установлены различия в таксономическом составе в зависимости от МЭС. Время культивирования может изменить таксономических состав: добавить конкретику.

1. 1. Функциональные показатели иммобилизованных клеток

1. 1. 1. Концентрация зелёных пигментов

Концентрация хлорофилла a, b и c в клетках водорослей, иммобилизованных на вспененном полиэтилене в МЭСах представлена в таблице 4

Таблица 4 — Концентрация хлорофилла a, b и c в клетках водорослей, иммобилизованных на вспененном полиэтилене в МЭС-1 и МЭС-2.

Пигмент	МЭС — 1	МЭС — 2
	33 суток	23 суток	33 суток
хл А, мг/м2	40,08+0,37	26,01+2,05	22,95+2,3
хл В, мг/м2	0	5,54+0,59	3,87+0,24
хл С, мг/м2	4,78+0,11	Не определяли	4,3+0,42

Содержание хлорофилла а на ВПЭ в МЭС-1 на 33 сутки было максимально и составило 40,08+0,37, что соответствует средним значениям данного показателя для фитоперифитона малых рек Кольского полуострова, сформированного видами с нитчатой структурой таллома (Ulothrix  zonata, Bulbochaete sp., Oedogonium sp., Spirogyra sp., Zygnema sp., Mougeotia sp.), которые изменялись от 28 до 88 мг/м² (Кумулайнен и др., 2009).  В МЭС-2 по сравнению с МЭС-1 меньшая концентрация хлорофилла а на 33 сутки может быть объяснена наличием в экосистеме рыб вида  — предпочитающие в естественных условиях питаться бентосом (Dussault, Kramer, 1981), а в аквариуме (МЭСе) водорослями в составе перифитона. Эта же причина может объяснять уменьшение концентрации пигментов от 23 к 33 суткам.

1. 1. 1. Биомасса иммобилизованных водорослей

Зарегистрированная концентрация хлорофилла а в составе иммобилизованных клеток позволяет рассчитать сырую биомассу клеток водорослей. Для этого необходимо использовать величину отношения β=Схл/В. Многочисленные исследования демонстрируют изменчивость этого показателя. В работе (Апонасенко, 2007) указан интервал изменения величины β от 0,1 до 9,7%. Средние значения β для реки Енисей составляли 1,33%, для Красноярского водохранилища – 0,54 %. Отношение хлорофилл/биомасса в перифитоне составляло от 0,18 до 0,49% (Кумулайнен и др., 2009). В качестве переводного коэффициента используются данные работы В.В. Бульона  (1983). По его оценке, сделанной на основе большого количества измерений, среднее значение β равно 0,2%, или хлорофилл а составляет 1/500 часть от сырой биомассы клеток водорослей. 

Ожидаемая суммарная сырая биомасса клеток водорослей составила в МЭС-1 и в МЭС-2, соответственно 20,0 и 11,4 г/м².

При необходимости от значений сырой биомассы можно перейти к сухой биомассе и рассчитать массовые доли углерода, азота, фосфора, а также тяжёлых металлов. Также на основе расчёта сухой биомассы можно определить способность к изъятию тяжёлых металлов из среды. Для этого потребуется провести дополнительные исследования.

1. 1. 1. Структурно-функциональные характеристики

Уровень флуоресценции водорослей связан с количеством пигментов в составе ФС-2. Показателем количества хлорофилла выступает Fm максимальный выход флуоресценции. Кроме этого флуоресценция хлорофилла даёт возможность определить таксономическую структуру исследуемого фитоперифитона и фотосинтетическую активность трёх основных отделов: синезелёных, зелёных и диатомовых водорослей. 

Результаты оценки таксономической структуры  в МЭС-1 и МЭС-2 в разные сроки приведены в таблице 5

Таблица 5 – Максимальный уровень флуоресценции иммобилизованных клеток водорослей

Отделы водорослей	Fm, отн. ед.
	МЭС — 1		МЭС — 2
	23 суток	33 суток	23 суток	33 суток
Синезелёные	405,3+69	472,3+30,6	316,6+178	169+44,4
Зелёные	0	0	331+331	855+282
Диатомовые	977,3+88,7	1023,3+5,6	3497+529,5	2527,6+621,5
Сумма	1382,6	1495,6	4144,6	3552

Функциональную активность иммобилизованных водорослей отражает скорость нециклического транспорта электронов (ETR) при фотосинтезе. Флуоресцентный анализ с использованием Imaging PAM позволяет определить  ETR в мкмоль электронов◊м^-2◊сек^-1. Полученные в эксперименте значения ETR приведены в таблице ххх.

Таблица 6 – Максимальная скорость фотосинтетического транспорта электронов иммобилизованных клеток водорослей

Отделы водорослей	ETR, мкмоль электронов◊м2◊сек1 над чертой;  г О2 ◊м-2◊час-1 под чертой
	МЭС — 1		МЭС — 2
	23 суток	33 суток	23 суток	33 суток
Синезелёные	50,5±2,13 1,45	48,9±9,26 1,40	0	0
Зелёные			11,4±3,8 0,33	32,7±3,9 0,94
Диатомовые	17,1±1,09 0,49	19,3±0,78 0,56	21,2±3,78 0,61	20,9±3,13 0,60

Величина ETR может быть переведена в показатель валовой первичной продукции водорослей, которая в гидробиологических исследованиях выражается г О₂ ◊м^-2◊час^-1 (Шира, 2006, перифитон Енисей). Переводной коэффициент от мкмоль электронов◊м²◊сек¹  в г О₂ ◊м^-2◊час^-1  определяли на основе следующих величин: 1 час = 3600 секунд, 1мкмоль = 10^-6 моль, M.m. О₂ = 32 г/моль, квантовый расход выделения 1 моля О₂ = 4 молям фотонов. Таким образом, 1 мкмоль электронов◊м²◊сек¹  = 2,88◊10^-2 г О₂◊м²◊час¹. Расчетные значения валовой первичной продукции водорослей приведены в таблице хх.

Полученные величины валовой первичной продукции иммобилизованных клеток уступают первичной продукции фитоперифитона р. Енисей (Ануфриева Т.Н. и др., 2003), но существенно превосходят продукцию фитоперифитона оз. Шира (Горбанева Т.Б. и др. 2006).

Иммобилизация хлореллы из накопительной культуры осуществляли в среде Тамия во вращающемся культиваторе. Результат иммобилизации показан на рисунке 4.

 

Рисунок 4 – Хлорелла, иммобилизованная на вспененном полиэтилене. Экспозиция 4 суток.

Заполнение поверхности кубиков клетками хлореллы было не полным, в отличие от клеток водорослей из МЭС-1 и МЭС-2 (рис. 3). Адгезия клеток хлореллы на ВПЭ была слабой. При слабом встряхивании часть клеток переходила в  суспензию.

Максимальное количество хлорофилла а  у иммобилизованных клеток хлореллы составляло 69,5±11,4 мг/м². В условиях иммобилизации хлорелла проявляла низкую фотосинтетическую активность – максимальный квантовый выход ФС2 составлял 0,262±0,032, максимальная скорость транспорта электронов – 0,69±0,14 мкмоль электронов◊м^-2◊сек^-1. По этим показателям полученная иммобилизованная культура хлореллы значительно уступает иммобилизованных клеткам водорослей из МЭСов (табл. 5,6).

1. Устойчивость иммобилизованных клеток водорослей к модельному токсиканту (сульфату меди)

Действие ионов меди в различной концентрации исследовали на иммобилизованных клетках водорослей из МЭС-1, таксономический состав которых показан в таблице 3. Экспозиция составляла 2 и 5 суток. Результаты влияния ионов меди на флуоресценцию и фотохимическую активность показаны на рисунках 5,6,7.

 

Рис. 5 – Действие ионов меди на максимальный выход флуоресценции иммобилизованных клеток водорослей.

   

Рис. 6 – Действие ионов меди на максимальный квантовый выход флуоресценции иммобилизованных клеток водорослей.

 

Рис. 7 – Действие ионов меди на максимальную скорость фотосинтетического электронного транспорта иммобилизованных клеток водорослей.

Токсическое действие ионов меди проявилось во всех опытах, начиная с концентрации 5◊10⁵ М, и выражалось в снижении максимального выхода флуоресценции, максимального квантового выхода ФС2 и максимальной скорости фотосинтетического транспорта электронов. В отдельном опыте на 2 сутки культивирования клеток  в присутствии ионов меди скорость транспорта электронов снизилась при концентрации 5◊10⁶ М (рис. 7). При концентрациях ионов меди менее 5◊10⁵ М клетки сохраняли высокую фотосинтетическую активность.

Установленные токсичные для иммобилизованных культур концентрации ионов меди значительно превосходили эти концентрации в отношении фотосинтетических показателей высшего растения элодея (Зотина и др., 2009). По максимальному уровню флуоресценции действие ионов меди на элодею проявилось на вторые сутки при концентрации  1,5◊10⁷ М.

Большая устойчивость к ионам меди у иммобилизованных культур может быть полезным при их использовании в биоремедиации водных экосистем. 

ВЫВОДЫ

1. По физико-химическим характеристикам вспененный полиэтилен удовлетворяет требованиям, предъявляемым для материалов, используемых для иммобилизации клеток водорослей.
2. Клетки нитчатых синезеленых и зеленых водорослей, а также отдельные клетки диатомовых водорослей способны образовывать ассоциации на вспененном полиэтилене. Плотность заселения водорослями из МЭС кубиков из ВПЭ сопоставима с таковой для водорослей в составе фитоперифитона. Иммобилизованные на ВПЭ водоросли обладают высокой фотосинтетической активностью. 
3. III.Зеленая водоросль хлорелла показала низкую способность к иммобилизации на кубиках из ВПЭ при использовании среды 1% Тамия.
4. Иммобилизованные клетки нитчатых синезеленых и зеленых водорослей, а также отдельные клетки диатомовых водорослей показали устойчивость фотосинтетических характеристик к  ионам меди при  концентрациях от 10^-7 до 10^-5 М. Это позволяет использовать иммобилизованные на ВПЭ клетки при фиторемедиации водной среды.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nirupama Mallick. Immobilization of microalgae // Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells, Second Edition, 2006.- V.22.- P. 373-391. 
2. Ying Xia Li, Suo Zhou, Feng Juan Zhao, Yan Liu3, Pan Pan Fan, Gang Ce Wang.  Physiological responses of Porphyra haitanesis to different copper and zinc concentrations // Brazilian Journal Of Oceanography, 2010.-58(4).-P. 261-267. 
3. Muthukannan Satheesh Kumar, Kamaraj Rajeshwari, Shani Johnson, Nooruddin Thajuddin, Muthukumaran Gunasekaran. Removal of Pb (II) by Immobilized and Free Filaments of Marine Oscillatoria sp. Ntms01 and Phormidium Sp. Ntms02 // Bull Environ Contam Toxicol, 2011.-87.-P. 254–259.
4. John J. Tate, M. Teresa Gutierrez-Wing, Kelly A. Rusch, Michael G. Benton. The Effects of Plant Growth Substances and Mixed Cultures on Growth and Metabolite Production of Green Algae Chlorella sp.: A Review // Plant Growth Regul, 2013.-32.-P. 417-428
5. Rashid N., Lee K., Jong-in Han, Gross M. Hydrogen production by immobilized Chlorella vulgaris: optimizing pH, carbon source and light // Bioprocess Biosyst Eng, 2012.
6. Garbayo I., Forja E., Salguero A., Cuaresma M., Vega  J.M., Vilchez C. Enhancement of photorespiration in immobilized Chlamydomonas reinhardtii cells // Biotechnology Letters, 2005.-27.-P. 265-267.
7. Correˆa A. X. R., Tamanaha M. S., Horita C. O., Radetski M. R., Correˆa R., Radetski C. M. Natural impacted freshwaters: in situ use of alginate immobilized algae to the assessment of algal response // Ecotoxicology, 2009.-18.-P. 464–469.
8. Jing Shi,  Björn Podola, Michael Melkonian. Removal of nitrogen and phosphorus from wastewater using microalgae immobilized on twin layers: an experimental study // Appl Phycol, 2007.-19.-P. 417–423.
9. Pérez-Martínez C., Sánchez-Castillo P., Valle Jiménez-Pérez M. Utilization of immobilized benthic algal species for N and P removal // Appl Phycol, 2010.-22.-P. 277-282.
10. Pane L., Feletti M., Bertino C., Carli A. Viability of the marine microalga Tetraselmis suecica grown free and immobilized in alginate beads // Aquaculture International, 1998.- 6.-P. 411–420 .
11. Subhashree Pradhan, L.C. Rai. Copper removal by immobilized Microcystis aeruginosa in continuous flow columns at different bed heights: study of the adsorption/desorption cycle // World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2001.-17.-P. 829–832.
12. Mohamed Sayed Abdel Hameed, Ola Hammouda Ebrahim. Biotechnological Potential Uses of Immobilized Algae // International Journal Of Agriculture & Biology, 2007.-09(1).-P. 183–192.
13. Sri Kumaran N., Sundaramanicam A., Bragadeeswaran S. Adsorption Studies on Heavy Metals by Isolated Cyanobacterial Strain (Nostoc sp.)  From Uppanar Estuarine Water, Southeast Coast of INDIA // Journal of Applied Sciences Research, 2011.-7(11).-P. 1609-1615.
14. Mamta Awasthi, Debanghshu Narayan Das. Heavy metal stress on growth, photosynthesis and enzymatic activities of free and immobilized Chlorella vulgaris // Annals of Microbiology, 2005.-55(1).-P 1-7.
15. Fathi A. A., Zaki F. T., Ibraheim H. A.  Response of tolerant and wild type strains of Chlorella vulgaris to copper with special references to copper uptake system // Protistology, 2005.-V.4 (1).-P. 73-78.
16. Dussault G.V., Kramer D.L. Food and feeding behavior of the guppy, Poecilia reticulate (Pisces Poecilidae) // Canadian Journal of Zoology, 1981.-59(4).-P. 684-701.
17. Jeffrey S. W. and Humphrey G. F.  New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a1, b1, c1 and c2  in higher plants, algae and natural phytoplankton. // Biochem. Physiol. Pflanzen,  1975.-P.167, 191–194.
18. Naessens M., Leclerc, J.-C., Tran-Minh, C., Fiber optic biosensor using Chlorella vulgaris for determination of toxic compounds // Ecotoxicol. Environ. Saf.,  2000.- V.46.- P.181–185
19. Brzezinska E., Kozlowska M., Stachowiak J. Response of Three Conifer Species to Enhanced UV-B Radiation; Consequences for Photosynthesis // Polish J. of Environ. Stud., 2006.- V.15, N.4.-P. 531-536.
20. Genty B., Briantais J-M., Baker N.R. (1989) The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim Biophys Acta, 1989.-V.990.-P. 87–92.
21. Saravia L.A. , Giorgi A., Momo F.R. A photographic method for estimating chlorophyll in periphyton on artificial substrata // Aquatic Ecology, 1999.-V. 33.-P. 325–330.
22. Kursar T.A., Van Der Meer J., Alberte R.S. Light-harvesting system of the red alga Gracilaria tikvahiael I. Biochemical analysis of pigment mutation // Plant Physiol, 1983.-V. 73.-P. 353-360.
23. Wilhelm C., Kramer P., Wiedemann I. Die Lichtsammelkomplexe der verschiedenen Algenstämme . Phylogenetische Vielfalt eukaryotischer Photosynthese apparate  // Biologie inunserer Zeit, 1987,Nr. 5, p.138-143
24. Yentsch C.S., Phinney D.A. Spectral fluorescence: atoxonomic tool for studying the structure of phytoplankton population // J. Plankton Reas., 1985.-V.7.-N.5. P. 671-632.
25. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. М., Наука, 1971.-с.154.
26. Электронный ресурс: Вспененный полиэтилен http://www.polyairpack.ru/production/?id=19; http://www.avalot.ru/product/2.html.
27. Ануфриева Т.Н., Гаевский Н.А., Горбанева Т.Б., Коваленко Н.Е. Фитоперифитон реки Енисей в условиях комплексного антропогенного воздействия // Экология, 2003.
28. Апонасенко А.Д., Щур Л.А., Лопатин В.Н. Связь содержания хлорофилла с биомассой и дисперсной структурой фитопланктона // Докл. РАН, 2007.-Т. 412.- № 5.- С. 710–712.
29. Бульон В.В. Первичная продукция планктона внутренних водоемов. // Л.: Наука, 1983. 150 с.
30. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Шатров И.Ю., Попельницкий В.А.. Рыбцов С.А. Опыт использования  флуоресценции для  дифференциальной оценки  содержания хлорофилла а у планктонных водорослей // Гидробиологический журнал, 1986.-Т.22.-№3.-с.80-85
31. Горбанева Т.Б., Гаевский Н.А., Ануфриева Т.Н., Хакимьянова Л.Т. Определение первичной продукции фитоперифитона озера Шира (Хакасия) на основе флуоресцентного метода // Вестник КрасГУ, 2006.- С.48-51.
32. Зотина Т.А., Гаевский Н.А., Радионова Е.А. Оценка токсичности тяжелых металлов для водного растения Elodea canadensis // Журнал Сибирского федерального университета. Биология, 2009.-N.2.-с.226-236
33. Китаев С.П. Экологические основы биопродуктивности озер разных природных зон // М.:Наука,1984 — 207 с.
34. Кумулайнен С.Ф., Круглова А.Н., Барышев И.А. Сообщества гидробионтов малых рек северо-западной части Кольского полуострова // Сохранение биологического разнообразия наземных и морских экосистем в условиях высоких широт: Материалы Международной научно-практической конференции. Мурманск, 13-15 апреля 2009 г. / Науч. ред. Н.В. Василевская — Мурманск: МГПУ, 2009. C. 114-117.
35. Медведев С.С. Физиология растений // СПб.: БХВ-Петербург, 2013.-512с.
36. Оксиюк О.П., Жукинский В.Н., Брагинский Л.П. и др. Комплексная экологическая классификация качества поверхностных вод суши // Гидробиологический журнал, 1993.- Т.29. -№ 4.- С. 62-77.
37. Рабинович Е. Фотосинтез // М.: Изд-во ИЛ, 1951, Т. 1. С. 410-412.
38. Ратушняк А.А., Абрамова К.И., Муравьёва А.С., Иванов Д.В. К вопросу о некоторых адаптационных физиолого-биохимических и анатомо-морфологических перестройках Typha angustifolia L. В условиях нагрузки по азоту // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2008.-№.3, с. 98–104.