Эксперт

Сергей

Задать вопрос

Мы готовы помочь Вам.

Содержание

Введение

Комплекс биологических наук, изучающих механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации, строение и функции нерегулярных биополимеров – белков и нуклеиновых кислот на протяжении ХХ века преобразовался в самостоятельную научную дисциплину — молекулярной биологии или молекулярную биологию гена.

Возникнув как биохимия нуклеиновых кислот, молекулярная биология пережила период бурного развития собственных методов исследования, которыми теперь отличается от биохимии. К ним, в частности, относятся методы генной инженерии, клонирования, искусственной экспрессии и нокаута генов. Поскольку ДНК является материальным носителем генетической информации, молекулярная биология значительно сблизилась с генетикой, и на стыке образовалась молекулярная генетика, являющаяся одновременно разделом генетики и молекулярной биологии [].

Начало ХХ ознаменовалось открытием явления радиактивности. Радиобиологи́ческий парадо́кс, заключавшийся в несоответствие между ничтожным количеством поглощённой энергии ионизирующего излучения и крайней степенью реакции биологического объекта, вплоть до летального исхода поставило во главу угла необходимость поиска мишеней для ионизирующих излучений. Этой мишенью оказалась молекула ДНК. Основным явлениям реализации биологического действия радиации – мутация. На протяжении ХХ столетие радиобиология развивалась в основном как радиационная генетика.

В конце ХХ расширяющееся распространение источников ЭМИ стало вызывать тревогу научной общественности. Стало понятно, что ЭМИ, обладая меньшей, чем ионизирующих излучений энергией, не способны приводить к прямым поражением ДНК, а их генетические эффекты в основном реализуются через изменение экспрессии генов. В это время в генетики формируется новое направление, изучающее изменение экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательность ДНК [].

В ФГУП «Российский Федеральный ядерный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной физики» (г.Саров) на протяжении многих лет параллельно с развитием исследований по радиационной физики развивались радиобиологические исследования, изучающие биологические эффекты ионизирующих излучений на клеточно-молекулярном уровне. В последние десятилетия комплекс методик, позволяющий разносторонне оценивать клеточные эффекты действия ионизирующих излучений, был адаптирован для исследования биологического действия слабых электромагнитных полей.

В связи этим представляется уместным осветить некоторые моменты развития исследований изучению мутационного процесса и становление новой для второй половины ХХ века области генетики – эпигенетики – как направлений исследований по молекулярной биологии гена.

1. 1.Развитие молекулярной биологии
   1. 1.1.Формирование представлений об организации материального субстрата наследственности и изменчивости

Наследственность и изменчивость как важнейшие свойства любой живой системы обеспечиваются функционированием особого материального субстрата. В ходе исторического развития биологической науки представления о его свойствах, организации и химической природе постоянно расширяются и усложняются. 

В 60-х гг. XIX в. основоположник генетики Г. Мендель (1865) высказал первые предположения об организации наследственного материала. На основании результатов своих экспериментов на горохе он пришел к заключению, что наследственный материал дискретен, т.е. представлен отдельными наследственными задатками, отвечающими за развитие определенных признаков организмов. По утверждению Менделя, в наследственном материале организмов, размножающихся половым путем, развитие отдельного признака обеспечивается парой аллельных задатков, пришедших с половыми клетками от обоих родителей. При образовании гамет в каждую из них попадает лишь один из пары аллельных задатков, поэтому гаметы всегда «чисты». В 1909 г.В. Иогансен назвал «наследственные задатки» Менделя генами.

80-е гг. XIX в. ознаменовались важными достижениями в области цитологии: были описаны митоз и мейоз — деление соответственно соматических и половых клеток, в ходе которых закономерно между дочерними хромосомы (В. Вольдейер, 1888). 

Данные о характере распределения хромосом в процессе клеточного деления позволили в начале XX в.Т. Бовери (1902-1907) и У. Сетгону (1902-1903) сделать вывод о том, что преемственность свойств в ряду поколений клеток и организмов определяется преемственностью их хромосом. Хромосомы стали рассматривать как материальные носители наследственной программы. 

Дальнейшая разработка хромосомной теории наследственности, объединяющей представления о наследственных задатках и хромосомах, была осуществлена в начале XX в. Т. Морганом и его сотрудниками. В опытах, выполненных на дрозофиле, было подтверждено ранее высказанное предположение о роли хромосом в обеспечении наследственности. Установлено, что гены размещаются в хромосомах, располагаясь в них в линейном порядке. Гены каждой хромосомы образуют группу сцепления, число которых определяется количеством хромосом в половых клетках. Гены одной группы сцепления наследуются, как правило, совместно. Однако в ряде случаев происходит их перекомбинация в связи с кроссинговером, частота которого зависит от расстояния между генами. В хромосомной теории нашел отражение один из важнейших принципов генетики — единство дискретности и непрерывности наследственного материала.

Однако, данные, полученные в первые десятилетия XX в. свидетельствуют в пользу зависимости состояния признаков от характера взаимодействия генов, что выходило за рамки отношений доминантности и рецессивности, описанных еще Менделем.

1. 1. 1.2.Первые исследования природы генетического материала

После того, как в 1910-х годах законы Менделя получили широкое признание в научных кругах, а в 1920-х годах развитие атомной теории привело к разработке принципов квантовой механики, казалось, что наука вплотную подошла к открытию молекулярного фундамента феномена жизни. Уоррен Уивер, директор отдела естественных наук Фонда Рокфеллера, поддерживал и финансировал исследования на стыке биологии, химии и физики. В 1938 г Уивером предложено название новой научной дисциплины — молекулярной биологии. Однако в 1930-х — 1940-х годах под молекулярную биология не было подведено теоритической базы, как это было сделано Нильсоном Бором и Эрвином Шрёдингером в теоретической физики.

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдуард Тейтем показали факт существования связи между генами и белками, связав генетику с биохимией. Они предложили генетикам вместо дрозофилы использовать в качестве модельного организма грибок нейроспору.

Использование более широкого спектра модельных организмов было чрезвычайно важно для появления новой дисциплины.

В 1944 г. Освальд Эвери, работавший в Рокфеллеровском университете с бактериями, показал, что гены состоят из ДНК, а в 1952 г. Алфред Херши и Марта Чейз одтвердили, что генетический материал бактериофага тоже состоит из ДНК.

1. 1. 1.3.Открытие структуры ДНК. Модель Уотсона-Крика

Вопрос о химической природе субстрата наследственности и изменчивости решался на протяжении всей первой половины ХХ века.

Первоначально высказывались предположения в пользу белков. В 1928 г.Ф. Гриффитом был поставлен опыт на пневмококках, в котором наблюдалось изменение (трансформация) некоторых наследственных свойств одного бактериального штамма под влиянием материала, полученного из убитых клеток другого штамма. Химическая природа вещества, трансформирующего наследственные свойства бактерий, была установлена лишь в 1944 г. О. Эйвери, доказавшим его принадлежность к нуклеиновым кислотам ДНК.

В 1950 г. английский физик М.Уилкинс получил рентгенограмму кристаллических волокон ДНК. Она показала, что молекула ДНК имеет определенную структуру, расшифровка которой помогла бы понять механизм функционирования ДНК. Рентгенограммы, полученные не на кристаллических волокнах ДНК, а на менее упорядоченных агрегатах, которые образуются при более высокой влажности, позволили Розалинд Франклин, коллеге М. Уилкинса, увидеть четкий крестообразный рисунок — опознавательный знак двойной спирали. Стало известно также, что нуклеотиды расположены друг от друга на расстоянии 0,34 нм, а на один виток спирали их приходится 10. Диаметр молекулы ДНК составляет около 2 нм. Из рентгеноструктурных данных, однако, было не ясно, каким образом цепи удерживаются вместе в молекулах ДНК.

Картина полностью прояснилась в 1953 г., когда американский биохимик Дж. Уотсон и английский физик Ф. Крик, исследуя структуру молекулы ДНК, пришли к выводу, что сахарофосфатный остов находится на периферии молекулы ДНК, а пуриновые и пиримидиновые основания — в середине. Причем последние ориентированы таким образом, что между основаниями из противоположных цепей могут образоваться водородные связи. Из построенной ими модели выявилось, что какой-либо пурин в одной цепи всегда связан водородными связями с одним из пиримидинов в другой цепи. Такие пары имеют одинаковый размер по всей длине молекулы. Не менее важно то, что аденин может спариваться лишь с тимином, а гуанин только с цитозином. При этом между аденином и тимином образуются две водородные связи, а между гуанином и цитозином – три.

В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили двухспиральную структуру молекулы ДНК. Их структурная модель Уотсона и Крика позволила объяснить многие фундаментальные биологические феномены, такие как: существование очень больших биологических молекул, способ хранения и точного копирования информации о их структуре, возможность изменения структуры генов в эволюции и др., в результате чего молекулярная биология обрела свои основные принципы.

1. 1. 1.4. Центральная догма молекулярной биологии

Спустя 5 лет в 1958 году Крик впервые опубликовал идею «центральной догмы» в, чтобы подытожить накапливающиеся сведения о молекулярных основах белкового синтеза. Доминирующей идеей тогда являлось то, что ДНК определяет наследственность, кодируя белковую структуру; вдобавок, подразумевалось, что белки определяют фенотип клетки и организма. Крик сформулировал два линейных потока информации, основанных на кодировании последовательностью нуклеотидов: ДНК — ДНК во время репликации и ДНК — РНК — белок во время синтеза белков [1].

Интересно как Крик писал о выборе слова «догма» и о вызванных этим выбором проблемах: «Я назвал эту идею центральной догмой, я подозреваю, по двум причинам. Я уже использовал слово гипотеза в гипотезе о последовательности, кроме того, я хотел предположить, что это новое допущение более центральное и сильное. Как оказалось, использование термина догма вызвало больше неприятностей, чем оно того стоило. Через много лет Жак Моно сказал мне, что по-видимому я не понимал, что подразумевается под словом догма, которая означает часть веры, не подлежащая сомнению. Я смутно опасался подобного значения слова, но поскольку я считал, что все религиозные убеждения не имеют основания, я использовал слово так, как понимал его я, а не большинство других людей, применив его к грандиозной гипотезе, которая, несмотря на внушаемое ею доверие, была основана на небольшом количестве прямых экспериментальных данных».

В 1970 году после открытия Мизутани и Теминым обратной транскриптазы, которая может копировать РНК обратно в ДНК, Крик пересматривает однонаправленный пототок передачи генетической информации и добавляет к свой схеме еще один переход от РНК к ДНК. Однако, он писал, что переход информации от белка к нуклеиновым кислотам или от белка к белку невозможен: «… информация последовательности ДНК не может быть перенесена от белка к белку или нуклеиновой кислоте» и «открытие хотя бы одного типа из ныне живущих клеток, который мог бы иметь какой-либо из трех неизвестных переходов (белок — ДНК, белок — РНК, белок — белок), пошатнуло бы все интеллектуальные основания молекулярной биологии…».

Сегодня, известно множество примеров, когда белки изменяют информацию в последовательности ДНК (например, SOS мутагенез), в РНК (сплайсинг и другие типы посттранскрипционной обработки) и других белках (протеолитическое расщепление, вырезание и прикрепление пептидов). Мы также обладаем гораздо более глубоким пониманием многочисленных путей, с помощью которых белки и другие молекулы клетки (вторичные посредники, мембраны, некодирующие последовательности РНК), не включенные в схему Крика, влияют на структуру, экспрессию и модификацию ДНК генома, а также РНК-транскриптов.

1. 2.История изучения мутационного процесса

Конец 19 – начало 20 века ознаменовалось открытием количественных закономерностей передачи наследственных признаков в ряде поколений и формированием представлений об организации материального субстрата наследственности и изменчивости.

Термин «мутация» в учение о наследственности в конце 19 века ввел голланский ботаник Г. Де Фриз. Он заимствовал этот термин у палеонтологов, называших «мутациями» резкие смены представителей ископаемой флоры и фауны в последовательных слоях геологических отложений. К этому же феномену восходит его концепция «мутационных периодов, признанная некоторые закорномерности эволюционного процесса. Кроме того, Де Фриз известен как исследователей, вторично открывший законы Мендаля. История изучения биологического процесса, ведущего к образованию мутаций, делится условно на пять периодов [].

Первый из них начался одновременно с переоткрытием законов Менделя и длился с 1900 г. почти четверть века. Были развиты представления о мутациях и о частоте их возникновения, разработаны методы их количественной оценки. Основной концептуальный вклад в эту область принадлежит Томасу Моргану и его школе. Морган, как уже отмечалось, «материализовал» понятие мутаций, связав их с изменениями генетических локусов хромосом. Ученик и последователь Моргана Меллер в 1921 году высказал идею о сохранении способности гена к самовоспроизведению при изменении его свойств. «Когда изменяется структура гена… каталитические свойства гена могут соответственно измениться так, чтобы сохранить его способность к автокатализу». Это свойство генов получило впоследствии название конвариантной редупликации.

Г. Меллеру же принадлежит концепция «скорости генетического процесса». В 1927 году он ввел в практику применяемый до сих пор на дрозофиле метод измерения этой скорости, за что получил Нобелевскую премию в 1946 г.

Второй период начался с открытия в 1925-1928 гг, когда проводятся исследования по радиационному мутагенезу, Н. В. Тимофеев-Ресовским и Циммером формулируются основные положения теории мишени, происходит открытие мутагенного действия ультрафиолетового излучения, ведется дискуссия о природе генных мутаций, представляют ли они собой истинные точковые мутации или внутригенные перестройки — делеции и дупликации. В этот период основным объектом для исследования закономерностей мутационного процесса становится D. Melanogaster.

Третий период, длившийся до 1953 г., ознаменован открытием химического мутагенеза и концепции предмутационных или потенциальных повреждений, что привело затем к открытию репарации ДНК. В эти же годы М. Е. Лобашов формулирует концепцию о возникновении мутаций в процессе нетождественной репарации клеточных повреждений.

Начало четвертому периоду было положено раскрытием структуры ДНК в 1953 г. Предложенная Уотсоном и Криком модель двойной спирали позволила на молекулярном уровне объяснить не только точность репликации генов, но и механизм возникновения возможных ошибок в них. В этот период, длившийся немногим более 10 лет,  была выдвинута идея Г. Меллера об автокаталитической способности генов, которая воплотилась в открытие авторепликации комплементарных цепей ДНК, проведено исследование химии нуклеиновых кислот и построение биохимической и молекулярной концепции мутагенеза, исследованы механизмы фоторепарации, мутагенной специфичности и индуцированной нестабильности. Однако, несмотря на эти успехи, отмечает Ш. Ауэрбах (1978), нестабильность гена оставалась «интригующей проблемой»[].

Вместе с тем накапливалось всё большее число фактов, указывающих на то, что возникновение мутаций — это сложный, многоступенчатый биологический процесс, тесно связанный с ростом и метаболизмом клеток, с активностью ферментов, вовлечённых в осуществление репликации, репарации и рекомбинации ДНК, с взаимодействиями ядерных и цитоплазматических генов. Изучением всех этих факторов мутагенеза в их совокупности характеризуется современный пятый период исследования проблем мутагенеза, начавшийся в начале 60-х годов с открытием явления репарации ДНК, т.е. восстановления её нормальной структуры после действия различных повреждающих агентов.

Итак, к середине 70-х годов стало очевидно, что мутации — это внезапно возникающие изменения генетического аппарата организма, приводящие к тем или иным изменениям его морфологических или физиологических признаков.

Специфическим для радиационного воздействия типом мутации, при которых изменяется структура хромосом, являются хромосомные аберрации. Впервые были обнаружены в экспериментальных исследованиях на D. Melanogaster. В некоторых скрещиваниях соотношение числа потомков в разных классах сильно отличалось от ожидаемого, что объяснили наличием перестроек в хромосомах родителей. К. Бриджес впервые описал делеции, дупликации и транслокации, а в 1921 г А.Стёртевант, сравнивая порядок генов в хромосоме 3 у D. melanogaster и D. Simulans, описал первую инверсию.

В современной генетике хромосомные перестройки выявляют и анализируют при помощи цитогенетических методов, наиболее часто анализ хромосомных перестроек проводят цитологически на стадии метафазы. Самым распространенным и доступным цитогенетическим методом является метод дифференциальной G-окраски хромосом (G-бэндинг). С конца 1980-х годов для выявления хромосомных перестроек применяют метод флуоресцентной гибридизации in situ с использованием ДНК-проб к отдельным хромосомам или хромосомным локусам.

Применение цитогенетических методов в ФГУП «Российский Федеральный ядерный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной физики» для оценки эффектов облучения началось в 70-е годы прошлого столетия. За эти годы были исследованы количественные закономерности образования аберраций при действии различных видов ионизирующих излучений, проведено цитогенетическое обследование когорт сотрудников института, которые подвергались профессиональному облучению.

1. 3.От генетики к эпигенетики

Сегодня ген все еще остается фундаментально гипотетической концепцией, под которой чаще всего понимают некоторый сегмент или сегменты ДНК, содержащие последовательную информацию, которая используется в качестве поддержки при строительстве белков или других продуктов, выполняющих биологическую функцию. Однако, морфогенез и функционирование органов человека и других видов млекопитающих, дифференцировка клеток и многие другие процессы контролируются не только генетическими, но и эпигенетическими механизмами регуляции [,,]

Термин «эпигенетика» (как и «эпигенетический ландшафт») был предложен Конрадом Уоддингтоном в 1942 году, как производное от слов генетика и эпигенез. Когда Уоддингтон ввел этот термин, физическая природа генов не была до конца известна, поэтому он использовал его в качестве концептуальной модели того, как гены могут взаимодействовать со своим окружением при формировании фенотипа [5].

Робин Холлидэй определил эпигенетику как «изучение механизмов временного и пространственного контроля активности генов в процессе развития организмов» [6]. Таким образом, термин «эпигенетика» может быть использован, чтобы описать какие-либо внутренние факторы, которые влияют на развитие организма, за исключением самой последовательности ДНК [5,6].

Использование этого слова в научном дискурсе является более узким. Греческий префикс epi- в слове, подразумевает факторы, которые влияют «поверх» или «в дополнение к» генетическим, а значит эпигенетические факторы воздействуют вдобавок или помимо традиционных молекулярных факторов наследствености.

Современные авторы продолжают уточнять и обсуждать определение эпигенетики. Наиболее часто использующееся в настоящее время определение эпигенетики было введено А.Риггсом в 90-х годах XX века и формулируется как «изучение митотически и/или мейотически наследуемых изменений в функции генов, которые не могут быть объяснены изменениями в последовательности ДНК» [7]. 

Одно из определений эпигенетики — в биологии, в частности в генетике — представляет собой изучение закономерностей эпигенетического наследования — изменения экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, не затрагивающими изменение последовательности ДНК [5]. Вместе с тем эпигенетика рассматривается как наука о наследуемых свойствах организма, которые не связаны с изменением последовательности нуклеотидов ДНК и могут быть опосредованно закодированы в геноме [].

Очевидно, что при обсуждении механизмов этого явления стала очевидной необходимость новой терминологии, введения новых понятий. Появилось понятие «эпигенетическая регуляция экспрессии генов» – потенциально наследуемый код, отличный от геномной последовательности нуклеотидов. Под эпигенетическим наследованием подразумевается способность различных состояний генетического материала (имеющих разные фенотипические отображения) быть переданными по наследству без каких-либо изменений в последовательности ДНК []. Под эпигенетической изменчивостью подразумевают наследуемые изменения генной активности. От мутаций они отличаются тем, что меняется активность, а не структура генетического материала, а от модификаций – тем, что вновь возникшее изменение генной активности наследуется в ряду поколений [].

В 1975 г. Артур Риггс, а также Р. Холлидей сообщили о том, что инактивация Х-хромосомы и, стало быть, половая дифференцировка у млекопитающих связаны с метилированием ДНК. Была открыта тканевая разнокачественность метилирования ДНК и было сформулировано представление о том, что метилирование ДНК – механизм регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки. На самом деле это был первый материальный химически идентифицированный и расшифрованный эпигенетический сигнал. Сформировано представление об эпигеноме, так что фенотип любого организма представляет собой суммарную реализацию генома и эпигенома. Уже вошли в употребление понятие и термин эпимутации. Наряду с генетическими болезнями существуют эпигенетические заболевания. Нарушения в эпигеноме вызывают рак, диабет, астму, многие психические и другие заболевания. В результате фундаментальных эпигенетических исследований изменились наши представления о генетической идентичности гомозиготных близнецов, клонов животных и растений. Оказалось, что они могут существенно различаться по эпигенетическим профилям. Сомаклональная изменчивость часто во многом обусловлена эпигенетическими изменениями [5].

Несмотря на грандиозные успехи молекулярной биологии и молекулярной генетики конца ХХ и начала ХI века очень многие важные проблемы общебиологического значения остаются нерешенными. И среди них важнейшими являются механизмы клеточной дифференцировки и регуляции активности генов. В связи с этим эпигенетика – новый обширный и многообещающий горизонт наших знаний в постгеномную эру. Действительно, мы наследуем нечто большее, чем сумму генов, а по мнению Нобелевского лауреата Д. Уотсона, «что-то еще и кроме последовательностей ДНК». Все это подчеркивает лишний раз, что без эпигенетики невозможно решение главной проблемы биологии – исследования пусковых механизмов регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки при разных условиях среды.

Заключение

История развития молекулярной биологии гена на протяжении конца ХIХ века – начала ХХI связана с изменением представления о единственной роли ДНК как материального носителя генетической информации.

Накапливающийся на протяжении ХХ столетие материал свидетельствует о том, что в реализации клеточного ответа на воздействие ДНК выступает как единая структурно-функциональная единица, признанная защитить себя как матрицу и другие клеточные элементы от разрушительного действия внешнего фактора.

Список литературы